Αρχή πειράματος
Η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης στοχεύει στην ανίχνευση και επιβεβαίωση διαφόρων φυσιολογικών και μη φυσιολογικών αιμοσφαιρινών.
Λόγω των διαφορετικών φορτίων και ισοηλεκτρικών σημείων διαφορετικών τύπων αιμοσφαιρίνης, σε ένα συγκεκριμένο διάλυμα ρυθμιστικού pH, όταν το ισοηλεκτρικό σημείο της αιμοσφαιρίνης είναι χαμηλότερο από το pH του ρυθμιστικού διαλύματος, η αιμοσφαιρίνη φέρει αρνητικό φορτίο και μεταναστεύει προς την άνοδο κατά την ηλεκτροφόρηση. Αντίστροφα, η αιμοσφαιρίνη με θετικό φορτίο κινείται προς την κάθοδο.
Κάτω από μια ορισμένη τάση και μετά από ένα συγκεκριμένο χρόνο ηλεκτροφόρησης, οι αιμοσφαιρίνες με διαφορετικά φορτία και μοριακά βάρη παρουσιάζουν διαφορετικές κατευθύνσεις και ταχύτητες μετανάστευσης. Αυτό επιτρέπει τον διαχωρισμό διακριτών ζωνών και μπορεί να πραγματοποιηθεί επακόλουθη χρωματομετρική ή ηλεκτροφορητική ανάλυση σάρωσης σε αυτές τις ζώνες για να ποσοτικοποιηθούν διάφορες αιμοσφαιρίνες. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η ηλεκτροφόρηση μεμβράνης με οξική κυτταρίνη pH 8,6.
Μέσα στο κυτταρόπλασμα, ομάδες αιθυλενογλυκόλης (CHOH-CHOH) που υπάρχουν σε γλυκογόνο ή πολυσακχαρίτες (όπως βλεννοπολυσακχαρίτες, βλεννοπρωτεΐνες, γλυκοπρωτεΐνες, γλυκολιπίδια κ.λπ.) οξειδώνονται με περιοδικό οξύ και μετατρέπονται σε ομάδες αλδεΰδης (CHO-CHO). Αυτές οι ομάδες αλδεΰδης συνδυάζονται με το άχρωμο πορφυρό-κόκκινο αντιδραστήριο Schiff, σχηματίζοντας μια μωβ-κόκκινη χρωστική που εναποτίθεται εκεί όπου υπάρχουν πολυσακχαρίτες στο κύτταρο. Αυτή η αντίδραση είναι γνωστή ως χρώση περιοδικού οξέος-Schiff (PAS), που παλαιότερα αναφερόταν ως χρώση γλυκογόνου.
Πειραματική Μέθοδος
Υλικά:Οξεική κυτταρίνημεμβράνη, συσκευή ηλεκτροφόρησης(DYCP-38C και τροφοδοτικό DYY-6C ), Superior Sample Loading Tool(σταγονόμετρο), φασματοφωτόμετρο, χρωματομετρικές κυψελίδες, buffers.
Ρυθμιστής:
(1) ΡΗ 8,6 TEB Ρυθμιστικό διάλυμα: Ζυγίστε 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g βορικό οξύ και προσθέστε απεσταγμένο νερό στα 1000 ml.
(2) Ρυθμιστικό διάλυμα βορικού: Ζυγίστε 6,87 g βόρακα και 5,56 g βορικό οξύ και προσθέστε απεσταγμένο νερό στα 1000 ml.
Διαδικασία:
Pαποκατάσταση του διαλύματος αιμοσφαιρίνης
Πάρτε 3 ml αίματος που περιέχει ηπαρίνη ή κιτρικό νάτριο ως αντιπηκτικό. Φυγοκεντρήστε στις 2000 rpm για 10 λεπτά και απορρίψτε το πλάσμα. Πλύνετε τα ερυθρά αιμοσφαίρια τρεις φορές με φυσιολογικό ορό (750 rpm, 5 λεπτά φυγοκέντρηση κάθε φορά). Φυγοκεντρήστε στις 2200 rpm για 10 λεπτά και απορρίψτε το υπερκείμενο. Προσθέστε ίση ποσότητα απεσταγμένου νερού και στη συνέχεια προσθέστε 0,5 φορές τον όγκο τετραχλωράνθρακα. Ανακινήστε δυνατά για 5 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε στις 2200 rpm για 10 λεπτά για να συλλέξετε το ανώτερο διάλυμα Hb για μελλοντική χρήση.
Διαβροχή της μεμβράνης
Κόψτε τη μεμβράνη οξικής κυτταρίνης σε λωρίδες διαστάσεων 3 cm × 8 cm. Μουλιάστε τα σε ρυθμιστικό διάλυμα pH 8,6 TEB μέχρι να κορεστούν πλήρως, στη συνέχεια αφαιρέστε τα και στεγνώστε τα με διηθητικό χαρτί.
Εντοπισμός
Χρησιμοποιήστε μια πιπέτα για να εντοπίσετε 10 μl διαλύματος αιμοσφαιρίνης κάθετα στη μεμβράνη της οξικής κυτταρίνης (η τραχιά πλευρά), περίπου 1,5 cm από την άκρη.
Ηλεκτροφόρηση
Χύστε το ρυθμιστικό διάλυμα βορικού στον θάλαμο ηλεκτροφόρησης. Τοποθετήστε τη μεμβράνη οξικής κυτταρίνης με την κηλιδωτή πλευρά στο άκρο της καθόδου του θαλάμου. Λειτουργήστε στα 200 V για 30 λεπτά.
Έκλουση
Κόψτε τις ζώνες HbA και HbA2, τοποθετήστε τις σε ξεχωριστούς δοκιμαστικούς σωλήνες και προσθέστε 15 ml και 3 ml απεσταγμένου νερού, αντίστοιχα. Ανακινήστε απαλά για να εκλουστεί τελείως η αιμοσφαιρίνη και μετά ανακατέψτε.
Χρωματομετρία
Μηδενίστε την απορρόφηση χρησιμοποιώντας απεσταγμένο νερό για το διάλυμα έκλουσης και μετρήστε την απορρόφηση στα 415 nm.
Λογαριασμός
HbA2(%) = Απορρόφηση σωλήνα HbA2 / (Απορρόφηση σωλήνα HbA × 5 + Απορρόφηση σωλήνα HbA2) × 100%
Υπολογισμός Πειραματικών Αποτελεσμάτων
Εύρος αναφοράς για pH 8,6 TEB ρυθμιστικό διάλυμα οξικής κυτταρίνης Ηλεκτροφόρηση: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Σημειώσεις
Ο χρόνος ηλεκτροφόρησης δεν πρέπει να είναι πολύ μεγάλος. Η μεμβράνη της οξικής κυτταρίνης δεν πρέπει να στεγνώνει κατά την ηλεκτροφόρηση. Σταματήστε την ηλεκτροφόρηση όταν τα HbA και HbA2 διαχωρίζονται σαφώς. Η παρατεταμένη ηλεκτροφόρηση μπορεί να προκαλέσει διάχυση της ζώνης και θόλωση.
Αποφύγετε τη χρήση υπερβολικού δείγματος. Η υπερβολική ποσότητα υγρού αιμοσφαιρίνης μπορεί να οδηγήσει σε αποκόλληση ταινίας ή ανεπαρκή χρώση, με αποτέλεσμα ψευδώς αυξημένα επίπεδα HbA.
Αποτρέψτε τη μόλυνση της μεμβράνης της οξικής κυτταρίνης με πρωτεΐνες.
Το ρεύμα δεν πρέπει να είναι πολύ υψηλό. Διαφορετικά, οι ζώνες αιμοσφαιρίνης μπορεί να μην διαχωριστούν.
Να συμπεριλαμβάνετε πάντα δείγματα από φυσιολογικά άτομα και απαραίτητες γνωστές μη φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες ως μάρτυρες.
Η Beijing Liuyi Biotechnology κατασκευάζει την επαγγελματική δεξαμενή ηλεκτροφόρησης για ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης που είναι το μοντέλοDYCP-38CΔεξαμενή ηλεκτροφόρησης μεμβράνης οξικής κυτταρίνης και υπάρχουν δύο διαθέσιμα μοντέλα τροφοδοσίας ηλεκτροφόρησης για τη δεξαμενή ηλεκτροφόρησης μεμβράνης οξικής κυτταρίνηςDYY-2CκαιDYY-6Cτροφοδοτικό.
Εν τω μεταξύ, η Beijing Liuyi Biotechnology παρέχει μεμβράνη οξικής κυτταρίνης για πελάτες και το μέγεθος της μεμβράνης οξικής κυτταρίνης μπορεί να προσαρμοστεί. Καλώς ήρθατε να μας ζητήσετε δείγματα και περισσότερες πληροφορίες.
Η επωνυμία Beijing Liuyi έχει περισσότερα από 50 χρόνια ιστορίας στην Κίνα και η εταιρεία μπορεί να παρέχει σταθερά και υψηλής ποιότητας προϊόντα σε όλο τον κόσμο. Μέσα από χρόνια ανάπτυξης, αξίζει την επιλογή σας!
Τώρα αναζητούμε συνεργάτες, τόσο η δεξαμενή ηλεκτροφόρησης OEM όσο και οι διανομείς είναι ευπρόσδεκτοι.
Εάν έχετε οποιοδήποτε σχέδιο αγοράς για τα προϊόντα μας, μη διστάσετε να επικοινωνήσετε μαζί μας. Μπορείτε να μας στείλετε μήνυμα στο email[email προστατευμένο]ή[email προστατευμένο], ή καλέστε μας στο +86 15810650221 ή προσθέστε Whatsapp +86 15810650221 ή Wechat: 15810650221
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-20-2023